染料法（如SYBR Green I）的工作原理是基于“通用型”的熒光染料能與任意雙鏈DNA結(jié)合。在PCR擴(kuò)增過程中，染料會(huì)嵌入所有新合成的雙鏈產(chǎn)物中，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。這意味著，只要有雙鏈DNA被擴(kuò)增，無論它是目標(biāo)產(chǎn)物還是非特異的引物二聚體或錯(cuò)配產(chǎn)物，都會(huì)被記錄下來。對于長度僅22nt左右的miRNA，其反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)本就復(fù)雜，極易形成引物二聚體，導(dǎo)致染料法產(chǎn)生“假陽性”信號(hào)，使得定量結(jié)果虛高，干擾對藥物療效或基因表達(dá)的真實(shí)判斷。

而探針法（如TaqMan探針法）則從原理上規(guī)避了這一風(fēng)險(xiǎn)。如相關(guān)服務(wù)中所概述的“基于探針的化學(xué)法”，它在反應(yīng)體系中引入了一條特異的熒光標(biāo)記探針。這條探針是一段能與目標(biāo)miRNA序列中部特異性結(jié)合的寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，熒光信號(hào)被淬滅。只有在PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)Taq酶的5'→3'外切酶活性遇到結(jié)合在模板上的探針時(shí)，會(huì)將其切割，使報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光。

這一機(jī)制決定了探針法具有雙重特異性：信號(hào)不僅來自于引物的正確擴(kuò)增，更來自于探針與目標(biāo)序列的成功雜交。只有當(dāng)引物和探針都與目標(biāo)miRNA匹配時(shí)，才能檢測到熒光累積。這相當(dāng)于為定量反應(yīng)加裝了一道“雙重驗(yàn)證”的門禁，有效過濾了由引物二聚體或其他非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生的噪音。

因此，在那些對數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性要求高的場景中——例如區(qū)分序列高度同源的miRNA家族成員、在珍貴臨床樣本中進(jìn)行絕對定量分析，或是需要建立嚴(yán)格量效關(guān)系的藥物療效考核中——探針法憑借其良好的特異性，成為規(guī)避干擾、還原真實(shí)表達(dá)水平的更優(yōu)選擇。盡管成本相對較高，但它所提供的確定性，為后續(xù)的生物學(xué)解讀和臨床決策構(gòu)筑了堅(jiān)實(shí)可靠的基礎(chǔ)。

 

miRNA熒光定量檢測服務(wù)

產(chǎn)品介紹

Real Time PCR，即實(shí)時(shí)熒光定量PCR，也被稱為定量PCR或qPCR，是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法

由于定量PCR具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測、藥物療效考核、基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究、基因檢測、病原體檢測、動(dòng)植物檢測、食品檢測等各種領(lǐng)域

實(shí)驗(yàn)原理

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)類型概述: DNA結(jié)合染料法, 基于探針的化學(xué)法, 猝滅染料引物法

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

DNA及RNA定量；基因表達(dá)驗(yàn)證；等位基因鑒別；SNP分型；病原體和病毒檢測；多重PCR

實(shí)驗(yàn)結(jié)果